通行证 注册 | 登录
深蓝资讯
联系我们
客服QQ:123266075
客服QQ:123266075
工作时间
周一至周五:09:00-18:00 周六至周日:09:00-20:00
联系方式
幽 幽 :13065647450
   打印 繁体 关闭

HIV的检测程序及结果报告与解释

发布日期:2017-11-15 17:06:35 浏览:20次

QQ截图20170213030613.jpg

   人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的检测指标主要有抗-HIV、P24抗原和HIV RNA,特异抗体和抗原的检测方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、明胶颗粒凝集试验(PA)、免疫渗滤层析(胶体金或硒试纸条)、免疫荧光试验、化学发光免疫测定和蛋白印迹(WB)等。ELISA、PA、免疫渗滤层析和化学发光免疫测定均属于初筛试验。WB为HIV抗体的确认试验。HIV RNA的检测方法主要有实时荧光逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)、基于核酸序列的扩增试验(NASBA)、分枝DNA(bDNA)等。HIV RNA检测亦可作为抗-HIV、P24抗原免疫测定呈阳性反应时确认试验。

一、HIV感染后外周血循环中特异抗原、抗体及核酸的出现

HIV为双正链RNA病毒,病毒外膜为来自宿主细胞的磷脂双分子层,其间嵌有病毒的gp120与gp41蛋白。gp120位于病毒表面,gp41是跨膜蛋白,gp120与gp41以非共价形式结合在一起。病毒衣壳则主要由p24蛋白组成。

自AIDS的病因发现为HIV后,上世纪80年代中期,人们要求有快速的HIV-1感染筛选试验主要有两个目的:(1)为献血员血液的筛查提供一个快速、可靠和价廉的手段,从而降低经输血感染HIV的危险性;(2)为HIV感染的诊断提供敏感的方法。第一代用于献血员常规检测的ELISA试剂盒出现于1985年3月。受感染者的大量的血清学试验表明,其抗HIV抗体所针对的主要抗原基本上一致,尽管每个感染者间单个抗体的特异性及相对水平出现时间有所差异。HIV所编码的结构和调节蛋白有许多,但激发机体产生抗体并出现于血循环中的主要有三种:(1)膜(ewu)蛋白:前体膜糖蛋白gp160及其两个主要亚单位,gp120和gp140;(2)多聚酶(pol)蛋白:逆转录酶p66和核酸内切酶p31;和(3)核心(gag)蛋白:前体蛋白p55及其组成成份p24,p18和p15。

机体感染HIV后,血液中最早可检出的是病毒的RNA,大约在感染后的平均5~9天即可检出,约16天可检出P24抗原,约22天出现可检出的抗体。针对p24和病毒表面蛋白(尤其是gp160和gp41)为机体内最早出现的HIV抗体。在感染初期,即抗体出现之前,外周血循环中病毒核酸的含量最高,可达到10^6 IU/ml以上,出现抗体后,HIV RNA水平即下降,一般在10^4 IU/ml。

二、HIV感染的检测方法

抗-HIV ELISA作为一种HIV感染筛选实验,在测定的特异性和敏感性上,更为强调测定敏感性。因为一则有抗-HIV验证试验可对抗HIV ELISA阳性结果进行验证,二则抗-HIV测定如有漏检,可能会发生潜在的严重后果,如血站在筛选献血员时。

ELISA测定方法是HIV抗体检测最常用的初筛检测方法,其经历了从第一代到第四代的发展过程。第一代抗-HIV ELISA试剂盒是使用在体外培养的HIV裂解物作为抗原,而建立的间接抗体测定方法,但在不同的商品试剂盒中,病毒裂解物所含的每种主要HIV结构和表达蛋白可能有明显不同,尽管通常包括有外包膜糖蛋白(即gp120及其前体gp160)和gag衍生产物(尤其是p24和p17抗原)。间接ELISA测定方法所测得的抗-HIV抗体确切地说应是抗-HIV IgG,因为酶标二抗即抗人IgG,决定了这一点。使用HIV裂解物作为包被抗原所建立的ELISA方法所产生的假阳性主要是由于某些患者血清中针对某种共同HLA抗原(尤其是HLA-DR和其它Ⅱ类抗原)的污染物结合,其它如测定前对血清加热灭活、慢性血液透析患者、急性疟疾、麻疯分枝杆菌感染患者、系统性红斑狼疮等亦可致假阳性。

第二代抗-HIV检测试剂与第一代的不同点是,其采用基因工程重组抗原或合成肽替代培养病毒抗原,测定模式仍为间接法。由于基因重组抗原的应用,避免了因为HLA抗原所致的假阳性结果。

第三代试剂与第二代的不同点主要在测定模式上,其采用双抗原夹心法替代间接法。由于双抗原夹心法测得的抗-HIV,不仅是IgG类,还有IgM、IgA等,并且不用担心标本量大可能因为标本中非特异IgG干扰而出现假阳性结果,因为双抗原夹心的标本用量较间接法可大大增加。因此,第三代试剂与第二代试剂相比,测定敏感性大大提高。目前国产的抗-HIV ELISA试剂盒亦均为双抗原夹心法。

采用双抗原夹心一步法检测抗-HIV,需要注意的是由“钩状效应”所致的假阴性问题。HIV感染者中有些抗体滴度很高,采用可出现双抗原夹心一步法检测,可出现类似双抗体夹心一步法检测抗原的“钩状效应”现象。因此,为避免因“钩状效应”出现假阴性,在血站筛检献血员时,国产试剂盒均为二步法。

因此为改善抗-HIV ELISA测定的敏感性和特异性,人们将基因重组HIV抗原取代病毒裂解物作为包被抗原,基因重组HIV抗原不但纯度高,而且易于大量得到,亦能很好控制包被浓度和不同成分量的比例。但缺点是重组抗原可能在抗原决定基上有所损失,与天然蛋白相比由于糖基化的某些差异而可能有所不同。

所谓的第四代抗-HIV检测ELISA试剂盒,即为抗体和P24抗原联合检测试剂。用于献血员血液筛查可以缩短检测的窗口期。

蛋白印迹(WB)试验是抗-HIV的确认试验,其是将培养HIV裂解后,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使各抗原组分得到分离,再转印至硝酸纤维素膜上。抗体检测时,将血清标本加入至硝酸纤维素膜上,温育后,标本中的特异抗体即可与膜上相应抗原结合,洗涤后,再加入酶标抗人IgG抗体,温育洗涤后,再加入底物显色。

Western Blot试验结果的判断可按如下原则进行[中国疾病预防控制中心《全国艾滋病检测技术规范》(2009年修订版)],如为下述情况可判为阴性:①在整条膜上未出现任何显色条带;②未出现与已知分子量病毒蛋白相应的条带。在进行Western Blot试验中,常见膜上出现与已知分子量HIV抗原无关的条带,这些条带的出现通常与HIV抗原中混有某些可与HIV抗体产生交叉反应的蛋白所致。这种交叉反应条带的出现,不同厂家生产的试剂盒或同一厂家不同批号的试剂盒均不相同。Western Blot试验的阳性判断标准为:①在抗-P24、抗gp41和抗gp160/120三条带中,出现至少两条以上的阳性;其所依据的标准是由美国the Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors在1988年建立的,并于1989年为美国CDC( the Centers for Disease Contro1)所采用;②符合特定试剂盒提供的阳性判断标准,不能判断为阴性或阳性的Western Blot结果,可定为“不确定”。其主要表现在膜上出现与已知的HIV蛋白相关或其它未知蛋白(可能为非病毒蛋白)的反应条带,最常见的是抗-P24条带单独阳性和/或抗-P55条带阳性。其它常出现的非特异反应条带大部分可能是由于病毒裂解物内混杂有具交叉反应的HLA I类和Ⅱ类抗原所致,使用重组的HIV抗原替代病毒培养裂解物制备Western Blot硝酸纤维膜抗原条带,无疑将大大减少此类“不确定”结果的出现。“不确定”结果如果具有临床症状或HIV高危接触史的患者,则应立即对原样或新鲜样本(可能的话)重新检测,如仍为“不确定”,则可测定病毒核酸,或在数月内再次检测,此时如仍未出现明确的阳性,则基本上可以排除HIV感染的可能性。

Western Blot之所以不适用作HIV抗体筛查试验,主要是因为这种“不确定”结果的出现频率太高。有研究表明,在使用ELISA和PCR方法测定为阴性的同性或双性恋患者血清中,有20~30%使用Western Blot方法检测可出现一个或更多的条带,而且,在一年多的跟踪检查中,仍有70%抗HIV ELISA、HIV RNA RT-PCR测定阴性和Western Blot可疑的同性恋患者在做Western Blot时出现一条或多条带。对低危人群的研究,同样发现有这种情况。因此,Western Blot只适合作ELISA或其它抗HIV筛查试验阳性的确认试验。

HIV RNA检测在国内目前主要采用实时荧光RT-PCR方法。疾控部门和国内一些传染病医院,在进行HIV载量检测时,较多使用进口的bDNA试剂。临床检测病毒载量,目的是监控抗病毒治疗效果。血站献血员血液筛查则为定性检测,目前国内外均使用实时荧光RT-PCR和转录介导的扩增(TMA)方法。病毒核酸检测是到目前为止,能最大程度缩短检测窗口期的最有效方法。

三、HIV感染的检测程序

目前国际和国内的HIV抗体初筛检测试剂的特异性和敏感性都比较高,但除了上面的提到的一些疾病及交叉反应抗原的存在可致抗-HIV ELISA检测的假阳性外,特定检测试剂的阳性预示值还与特定感染的人群流行率有关。假定一个抗-HIV ELISA试剂盒的敏感性和特异性均为99.9%,如果HIV人群感染率为1.0%,则阳性预示值为91%,假阳性率小于10%,如果流行率为0.04%,则阳性预示值为28.4%,假阳性率大于71%。有研究表明,我国献血人群中用第三代试剂筛查阳性率为0.2%(2439/1,195,286),经确认阳性0.0009%(11/1,195,286)。因此,如按0.0009%的献血人群HIV感染流行率来计算,则假阳性率大于99%。因此,所有初筛试验呈阳性反应的标本都必须进行确认试验。按照中国疾病预防控制中心 《全国艾滋病检测技术规范》(2009年修订版),HIV感染检测的流程如下图所示。

QQ截图20170213030642.jpg

四、HIV感染测定结果的报告与解释

一个感染HIV的患者,其在感染后数月内使用商品ELISA试剂盒测定,结果应呈阳性反应,因为在这些试剂盒中所用的包被抗原主要为gag编码蛋白和病毒包膜蛋白,针对这些蛋白的抗体在HIV感染的机体免疫应答中出现最早,而ELISA的测定敏感性足以将其早期测出,因此如果怀疑有可能的HIV感染,但ELISA测定结果为阴性,则HIV感染的可能性很小。一般情况下,除非实验操作或试剂有问题或不能确定可能出现感染的确切日期,如果HIV抗体ELISA测定为阴性反应,就不必立即重复检测。对于处于阳性判断值(Cut-off)边缘即稍低于Cut-off的样本,难于判断是否为感染早期,或实际为非感染者的样本,此时,可以再次取血测定和/或用另一种ELISA试剂盒检测,从而明确测定结果。这种情况下,如果测定结果仍处于Cut-off边缘,则建议数月后再次测定,如仍无改变,则说明无HIV感染。其它如免疫印迹、PCR测定HIV RNA也为此种情况下的HIV感染验证实验。


  • 联系我们
  • 联系电话:0574-27896064
  • 联系地址:宁波市海曙区大梁街118号世纪广场B座2516室